Corpo carotídeo e hipertensão: alterações celulares e da matriz extracelular

O aumento de doenças cardiovasculares possui como fator primordial e, mais comum, o aumento da pressão arterial (PA). Esta, pode gerar complicações em outros órgãos e acarretar diversas patologias, podendo levar a morte. A hipertensão é uma síndrome multifatorial, cuja maior incidência ocorre em indivíduos obesos, sedentários e consumidores em excesso de bebidas alcoólicas e sal. O corpo carotídeo (CC) é um órgão quimiorreceptor localizado na bifurcação da artéria carótida, formado de estruturas básicas chamadas glomus. Cada glomus carotídeo é constituído de células tipo 1 envoltas por células tipo 2 ou sustentaculares. Este trabalho teve como objetivo analisar as alterações morfofuncionais que ocorrem no CC, causada por hipertensão arterial induzida pelo L-NAME, um inibidor da enzima óxido nítrico sintase. Para isso, o estudo utilizou 20 ratos Wistar divididos em dois grupos: controle (C) e L-NAME (LN). Após a administração de 40mg/kg/dia de L-NAME por 45 dias, o CC foi coletado. Observou-se aumento significativo da pressão arterial a partir da segunda semana de administração de L-NAME. Análise quantitativa mostrou uma redução no número de núcleos do glomus carotídeo e o aumento na área total do órgão no grupo LN. Não foi encontrado diferença significativa no número de núcleos totais do corpo carotídeo entre os grupos. Na análise morfológica do grupo LN, observamos a formação de vacúolos nas células tipo 1 do glomus, bem como uma redução do número total de núcleos das células de cada glomus carotídeo. A análise qualitativa sugeriu um aumento no número de fibras colágenas e fibras do sistema elástico na matriz extracelular e grânulos no grupo LN. Imunomarcações com anticorpo anti VEGF e NF-kB e nNOS mostram-se aumentadas e dispersas por todo CC no grupo LN em relação ao grupo C. Além disso, marcações para Substância-P também foram observadas em maior quantidade nas células tipo 1 do grupo LN. Quanto à marcação para PGP 9.5, houve a redução desta marcação caracterizada dentro do glomus carotídeo grupo LN comparado ao grupo C. O estudo sugere que o corpo carotídeo, em resposta à hipertensão induzida pela inibição da enzima óxido nítrico sintase, gera mudanças morfofisiológicas semelhantes as encontradas em hipóxia.

O transplante de células mononucleares de medula óssea contribui para o remodelamento da matriz extracelular durante a regeneração do fígado em ratos com fibrose hepática induzida por ligadura do ducto biliar

A fibrose hepática é o resultado de uma lesão crônica, com a ativação de células inflamatórias e fibrogênicas no fígado, as quais levam a um acúmulo excessivo de proteínas de matriz extracelular (MEC). Essas alterações resultam na morte de células do fígado, com desorganização e perda da função do parênquima hepático. A cirrose é o estágio avançado da fibrose, e culmina na falência hepática, uma condição potencialmente fatal cujo único tratamento efetivo é o transplante de fígado, o qual é limitado pela disponibilidade de órgãos. Na busca por terapias alternativas visando a regeneração hepática, o transplante de células mononucleares de medula óssea (CMMO) mostrou resultados benéficos e promissores em modelos animais e alguns protocolos clínicos. Entre essas células, estão as células-tronco hematopoiéticas e mesenquimais, que apresentam potencial regenerativo e modulador da resposta inflamatória. Este estudo pretendeu avançar na compreensão dos mecanismos pelos quais as CMMO podem ajudar na regeneração hepática. Ratos com fibrose hepática induzida por ligadura do ducto biliar (LDB) foram transplantados com CMMO e comparados com ratos com fibrose sem transplante e ratos normais. Parâmetros hepáticos como componentes da MEC (colágeno total, colágenos tipos I e IV, laminina, metaloproteinases de matriz MMPs), componentes celulares (células fibrogênicas, células de Kupffer e colangiócitos) e enzimas hepáticas foram analisados por microscopia de luz, microscopia confocal, western blotting e espectrofotometria. Os resultados mostraram que o transplante de CMMO contribui para a regeneração hepática de maneira global, (a) diminuindo o acúmulo de colágeno e laminina; (b) aumentando a produção de MMPs que favorecem o remodelamento da MEC, principalmente por células de Kupffer; (c) normalizando a quantidade de colangiócitos e diminuindo a quantidade de células fibrogênicas; e (d) normalizando os níveis sanguíneos das enzimas hepáticas. Portanto, nós sugerimos que as CMMO podem ajudar na regeneração hepática através de mecanismos parácrinos e se diferenciando em células de Kupffer, contribuindo para a secreção de fatores antiinflamatórios e anti-fibrogênicos no fígado com fibrose.

Estudo quantitativo da matriz extracelular e células do músculo liso de bexigas urinária após traumatismo raquimedular

Lesões na inervação do trato urinário inferior ocasionado por traumatismo raquimedular afetam geralmente o músculo detrusor e o esfíncteres uretrais. Estas alterações acarretam problemas basicamente de incontinência urinária e aumento da pressão intravesical, decorrente deste traumatismo, trazendo consequências para o funcionamento do sistema urinário superior. Quantificar os elementos fibrosos da matriz extracelular e fibras musculares das bexigas neurogênicas hiper-reflexas comparando-as com bexigas normais. Foram utilizadas 6 amostras de bexigas neurogênicas de indivíduos que foram submetidos a cirurgia de reparação por cistoenteroplastia realizados pelo serviço de urologia do Hospital Municipal Souza Aguiar, estas amostras foram fixadas imediatamente em solução tamponada de formalina a 10%. O controle com amostras iguais as do estudo extraída de cadáveres cuja causa morte não relacionava-se ao sistema urogenital macroscópicamente. O material foi submetido as seguintes técnicas histoquímicas: H&E, van Gieson e Resorcina Fucsina resorcina de Weigert com prévia oxidação pela oxona. Imunohistoquímica: anti-elastina. A observação dos cortes corados pelo van Gieson demonstrou uma diminuição significativa do músculo liso de 13% e aumento do colágeno em 72% e as fibras do sistema elástico um aumento de 101%. Conclusão. Nas bexigas neurogênicas hiper-reflexas o músculo detrusor e os elementos fibrosos da matriz foram profundamente modificados. As fibras do sistema elástico foram as mais afetadas.

Composição da matriz extracelular do ligamento cardinal de mulheres na pós-menopausa com e sem prolapso uterino

O prolapso uterino tem sua incidência aumentada na pós-menopausa. O objetivo deste estudo é identificar as alterações na matriz extracelular do ligamento cardinal associadas à menopausa e ao prolapso uterino. Ligamento cardinal de três diferentes grupos de mulheres, pré-menopausa, prolapso uterino e pós-menopausa, foram identificados e biopsiados durante 57 histerectomias abdominais ou vaginais. As amostras foram processadas por métodos bioquímicos para caracterização e quantificação de glicosaminoglicanos sulfatados e colágeno. As concentrações relativas de glicosaminoglicanos foram obtidas por eletroforese. Procedimentos histológicos foram feitos para identificar fibras elásticas (Weigert), distribuição de colágeno (Picro Sirius) e decorin (imunohistoquímica). Nossos resultados mostraram aumento na concentração de GAG de 72,2%, redução na concentração de colágeno de 37% e diminuição de 22% de fibras elásticas no grupo de prolapso uterino quando comparado ao grupo da pós-menopausa (p<0,05, p<0,04 e p<0,05 respectivamente). As concentrações relativas de glicosaminoglicanos sulfatados para condroitin sulfato, heparan sulfato e dermatan sulfato não mostraram diferenças entre os três grupos. A organização do colágeno foi similar entre os três grupos e a marcação do decorin pareceu estar diminuída no grupo de prolapso uterino. Nossos resultados indicam alterações no metabolismo do tecido conjuntivo. O ligamento cardinal da mulher na pós-menopausa possui uma matriz extracelular mais densa. Esta alteração não ocorre na mulher com prolapso uterino.

Análise da composição da matriz extracelular das camadas urotelial e muscular da bexiga de mulheres em diferentes idades

A complacência da bexiga depende de músculos lisos, fibras colágenas, fibras elásiticas e suas relações. O objetivo deste trabalho é determinar a composição da matriz extracelular em amostras de bexigas normais através de análise bioquímica de colágeno e glicosaminoglicanos em amostras obtidas de mulheres em diferentes grupos de idade, analisando separadamente as camadas urotelial e muscular. Avaliamos 17 amostras de bexiga divididas em três grupos: infância (N=5), menacme (N=6) e pós-menopausa (N=6). As bexigas foram analisadas para concentração de GAG total e colágeno e para análise qualitativa de GAG por eletroforese em gel de agarose. Na camada muscular, não houve diferença entre os grupos tanto para GAG quanto para colágeno. Na camada urotelial, a análise da concentração de colágeno não mostrou diferença entre os grupos, mas a concentração de GAG no grupo da pós-menopausa (0.21 0.12 μg de ácido hexurônico/mg de tecido seco) apresentou diferença em relação aos grupos do menacme (1.78 1.62 μg de ácido hexurônico/mg de tecido seco) e da infância ( 2.29 1.32 μg de ácido hexurônico/mg de tecido seco).Nosso trabalho concluiu que a concentração de GAG está substancialmente diminuída na camada urotelial da bexiga de mulheres na pós-menopausa.

Modulação da expressão dos componentes da matriz extracelular e a modulação celular na regeneração da fratura óssea padronizada em tíbia de ratos

O propósito do presente trabalho foi investigar a participação da proliferação celular e da expressão dos componentes da matriz extracelular na cascata de eventos do processo de reparo da fratura óssea, empregando as técnicas histológica, imunohistoquímica e morfométrica, em um modelo experimental padronizado para a indução da lesão na tíbia de ratos a partir do método empregado por Yuehuei e Friedman7. É importante padronizar um modelo de indução da fratura, para posterior investigação da participação das células e dos componentes da matriz extracelular no processo de reparo da fratura, considerando que o tempo de consolidação depende significantemente da natureza e do tipo da lesão produzida. Quarenta (n = 40) ratos Wistar foram submetidos a fratura . Os animais foram avaliados em oito (n = 8) grupos de cinco (n = 5) animais, cada grupo emperimental com 12, 24, 48, 72, 96, 144, 192 e 240 horas após a fratura (12h até 10 dias). As fraturas foram classificadas de acordo com o sistema de classificação internacional de fratura de Muller100, AO (Associação para Osteosíntese). Foram encontradas fraturas simples em 86% do total, sendo 68% de fraturas transversas e 18% de fraturas obliquas, 14% do total de fraturas foram complexas, sendo 8% de fraturas irregulares e 6% de fraturas segmentares. Esses resultados demonstram que o aparelho permite padronizar radiológicamente o tipo de fratura, caracterizado pela linha que separa os fragmentos ósseos. Os resultados qualitativos dos componentes da matriz extracelular para TGF-β, VEGF, colágeno I e II, osteopontina, proteoglicanos, fibras do sistema elástico com a coloração de resorcina funcsina de Weigert, e para proliferação celular pelo PCNA, assim como os resultados morfométricos, sugerem que a modulação da expressão dos componentes da matriz extracelular e a proliferação celular durante o processo de reparo da fratura não é homogênea para todos os componentes teciduais, dependendo significantemente das tensões locais geradas pelo tipo da linha de fratura que pode ser determinante no tempo de regeneração do osso e na qualidade da restauração das propriedades biomecânica. Nossos achados podem contribuir para melhor compreensão da reparo de fratura óssea e para novas abordagens terapêuticas que considerem as propriedades biomecânicas do tecido ósseo em reparo nas suas diferentes etapas

Alterações estruturais da matriz extracelular do prepúcio humano causadas pelo tabagismo

Os autores têm como objetivo, investigar a matriz extra celular, musculatura lisa e densidade vascular do prepúcio de pacientes tabagistas. Espécimes de prepúcio foram obtidas de 20 jovens adultos (média de idade= 27.2) submetidos a postectomia. Dentre os pacientes analisados, um grupo (n=10) possui história prévia de tabagismo (3 to 13 maços/ano, média = 5.8 3.2), e outro grupo (n=10) formam o grupo controle, não fumantes. A coloração de Tricrômico Masson foi utilizada para quantificar tecido conectivo, musculatura lisa e vasos. A coloração Resorcina-fucsina de Weigert foi utilizada para estabelecer as fibras do sistema elástico e a coloração, Vermelho de Picrosirius para o estudo do colágeno. O estudo estereológico foi realizado utilizando o software Image J, para determinar as densidades volumétricas. Para a análise bioquímica o colágeno total foi determinado em μg de hidroxiprolina por MG de tecido seco. O estudo estatístico foi realizado lançando mão do t-teste (p<0,05). Fibras do sistema elástico de fumantes apresentaram-se aumentadas em 42.5% quando comparado ao grupo controle (p=0,002). Em contraste, musculatura lisa (p=0,42) e densidade vascular (p=0,16) não mostraram nenhuma diferença estatística. Foi realizado uma análise quantitativa utilizando Vermelho de Picrosirius sob luz polarizada, que evidenciou a presença de colágeno tipo I e III, sem diferença estatisticamente significativa. A concentração total do colágeno não mostrou diferença entre tabagistas e o grupo controle. (73.1μg/mg 8.0 vs. 69.2μg/mg 5.9, respectivamente, p=0,23). Tabagismo está associado a um significante aumento de fibras do sistema elástico do tecido prepucial. Estes resultados podem, possivelmente, explicar os altos índices de falha na uretroplastia peniana, com uso de flap de prepúcio em fumantes

Alterações histopatológicas pancreáticas, placentárias e na matriz extracelular hipofisária durante a diabetes mellitus gestacional

A Diabetes Mellitus Gestacional (DMG) pode ser definida como intolerância a carboidrato durante a gravidez e estima-se que pode afetar 10-22% de todas as pacientes grávidas. Durante a gravidez podem surgir diversas complicações para o feto como risco elevado de aborto espontâneo, anormalidades congênitas e morbidade e mortalidade neonatal. Entretanto, podem surgir também alterações morfofuncionais em diversos órgãos da mãe diabética, porém isso não é bem estabelecido. Investigar se haverá ou não alterações bioquímicas e histopatológicas em diversos órgãos, como hipófise, útero, placenta e pâncreas de ratas grávidas com diabetes mellitus durante e no final da gravidez e compará-las . Além disso, investigar se há alteração na matriz extracelular (MEC) da hipófise desses animais. No 5 dia de vida, ratas Wistar foram divididas em dois grupos: um tratado com estreptozotocina (Grupo Diabético / DIAB), na dose de 90 mg/kg, subcutâneo e outro grupo, que foi tratado com veículo (tampão citrato/CTR). Aos 90 dias de vidas, foram submetidas ao cruzamento. Após isso, foram sacrificadas no 11 e 21 dia de gravidez. Foram avaliados glicemia e bioquímica maternal e número de implantes .O pâncreas, útero, placenta e hipófises foram coradas com Hematoxilina e Eosina e somente as hipófises foram coradas com Massom e Picrosirius, para avaliação da MEC.Os animais diabéticos tanto do 11 quanto do 21 dia apresentaram uma redução no número de implantes, menor peso e maior glicemia e colesterol total, em relação aos animais controle independente do dia da gravidez. Não foi verificada diferença dos níveis de triglicerídeos entre os grupos não diabéticos e diabéticos, independente dos dias. Entretanto, os animais diabéticos que finalizaram o período de gestação apresentaram uma maior glicemia maternal em relação ao grupo diabético do 11 dia. Pâncreas de ratas diabéticas do 21 dia apresentaram vacuolização intracitoplasmática das ilhotas, insulite,migração de células inflamatórias, espessamento da parede do vaso e fibrose periductal e vascular. Essas alterações foram verificadas com bem menor intensidade nos animais diabéticos do 11 dia. Foi verificado que a placenta de animais diabéticos apresenta congestão na interface materno-fetal, migração celular, maior concentração de vasos maternos e fetais, mas em forma irregular , necrose e vacuolização. A hipófise de animais diabéticos mostraram células cromófobas agregadas, aumento da espessura de fibras de colágeno vermelhas da MEC, em contraste com o controle, que foi visualizado fibras em verde e em formato de feixe. A diabetes desempenhou um total remodelamento da hipófise. Gravidez de animais diabeticos mostraram maior dano ao pâncreas e placenta, especialmente no final da gravidez. Em consequência dessa alterações, esses animais diabéticos apresentaram hiperglicemia, maior colesterol total, porém menor peso materno, número de implantes e sem alterações nos triglicerídeos. Esse é o primeiro estudo a demonstrar remodelamento tecidual em alguns elementos da MEC na hipófise, como espessamento da camada da MEC e fibras de colágeno em verde. Alterações da MEC da hipófise são provavelmente devido ao processo de diabetes na gestação.

Análise da expressão de laminina durante o transplante de células mononucleares de medula óssea em ratos hepatectomizados

A medula óssea adulta possui duas populações de células-tronco importantes no tratamento de diversas doenças hepáticas: células-tronco hematopoiéticas (CTHs) e células-tronco mesenquimais. A regeneração do fígado após a hepatectomia é um processo complexo que requer a proliferação de todas as células hepáticas. Fatores de crescimento, citocinas e componentes da matriz extracelular são elementos-chave nesse processo. As lamininas são uma família de proteínas de matriz extracelular, com funções adesivas e quimiotáticas pelo recrutamento de integrinas e outros receptores de superfície celular. No fígado normal, a laminina é expressa nas veias porta e centrolobular. O objetivo desse estudo foi investigar a expressão de laminina durante a regeneração hepática induzida por hepatectomia parcial e após o transplante de células mononucleares de medula óssea. As células mononucleares de medula óssea foram obtidas dos fêmures e tíbias de ratos, isoladas, marcadas com DAPI e injetadas pela veia porta em ratos recém-hepatectomizados. Os fígados foram coletados 15 minutos, 1 dia e 3 dias após a hepatectomia e o transplante de células de medula óssea e congelados. Os cortes foram imunomarcados com anticorpos primários anti-CD34 e anti-laminina de rato e observados em microscópio confocal de varredura a laser. Os resultados mostraram que 15 minutos após a hepatectomia parcial, as células-tronco hematopoiéticas CD34+ transplantadas foram encontradas em contato com a laminina localizada nas veias porta e centrolobular, indicando que a laminina poderia participar na adesão inicial das células-tronco a esses vasos logo após o seu transplante. Além disso, 1 e 3 dias após a hepatectomia, as células mononucleares de medula óssea transplantadas foram observadas nos sinusóides hepáticos expressando laminina. Esses resultados sugerem que a laminina pode ser um componente da matriz extracelular importante para a adesão e enxerto de células de medula óssea no fígado após uma lesão. Nós também analisamos a expressão de osteopontina (OPN) em células de medula óssea e CTHs. Os resultados por microscopia confocal demonstraram que a maioria das células mononucleares de medula óssea recém-isoladas expressa quantidades variáveis de OPN. Além disso, algumas CTHs CD34+ também expressam OPN. Após 1 e 4 dias de cultura, observamos uma diminuição de células expressando CD34, e um aumento na expressão de OPN pelas células mononucleares de medula óssea.

Alterações renais gênero-dependentes em ratos com insuficiência renal crônica

A insuficiência renal crônica (IRC) é caracterizada por alterações glomerulares secundárias aos mecanismos adaptativos ocasionados por perda de néfrons funcionantes. Alterações na hemodinâmica glomerular, proliferação celular, influxo de células inflamatórias, desequilíbrio na síntese de proteínas da matriz extracelular glomerular (MECG) e perda da seletividade de carga e/ou tamanho da membrana basal glomerular têm sido apontados como mecanismos envolvidos na expansão mesangial e conseqüente glomeruloesclerose. A participação dos hormônios sexuais na função renal e na evolução da insuficiência renal crônica tem sido sugerida. Os glicosaminoglicanos, especialmente o heparan sulfato (HS), têm sido associados à seletividade glomerular de macromoléculas. O remodelamento podocitário precoce e a proteinuria (PTN) se relacionam com a progressão da IRC. Neste contexto, o acúmulo de MECG, proliferação de miofibroblastos e PTN têm sido apontados como mediadores precoces que precedem as lesões glomerulares e túbulo-intersticiais. Neste estudo, avaliamos as alterações renais precoces (30 dias de IRC) gênero-dependentes em ratos (M) e ratas (F) Wistar submetidos à redução de 5/6 da massa renal (IRC) e à castração (c). Os animais foram divididos em 10 grupos: Controles (C) (CM, CF, CMc, CFc) e sham (CM sham, CF sham); e aqueles submetidos à nefrectomia 5/6: IRCM, IRCF, IRCMc, IRCFc. Os animais foram castrados com 5 semanas e submetidos à nefrectomia 5/6 com 7 semanas de idade. Resultados significativos mostraram que os machos com IRC apresentaram maior PTN, acompanhada de maior comprometimento mesangial, imunomarcação positiva para α-actina e maior concentração de heparan sulfato (HS) comparados com as fêmeas IRC (p<0,05). Estas alterações foram reduzidas nos machos castrados. A análise da morfologia podocitária mostrou raras regiões onde ocorreram alterações podocitárias nos grupos IRC. O conjunto de dados sugere que o hormônio masculino pode participar na manutenção do equilíbrio mesangial e que a PTN participa do processo de expansão mesangial. Adicionalmente, a maior concentração de HS nos machos com IRC sugere que durante o processo de remodelação da MEG, tenha ocorrido geração de HS de novo, funcionalmente defeituoso, comprometendo a barreira de filtração glomerular, corroborando com a perda de seletividade da mesma e, contribuindo para maior PTN neste grupo. As fêmeas com IRC apresentaram alterações mais discretas quando comparadas aos machos; apresentaram decréscimo de HS renal associado a PTN e a castração não alterou este perfil. Em resumo, a PTN ocorre precocemente na IRC, contribuindo para o desequilíbrio da MECG. Os mecanismos envolvidos nestes processos parecem sofrer influência dos hormônios sexuais; e os hormônios masculinos parecem agravar estas alterações, contribuindo possivelmente para um pior prognóstico da doença renal nos machos.

Estudo da adesão, sobrevivência e tubulogênese endotelial em modelo de células de glioma silenciadas para a expressão de Tenascina-C

Recentemente, nosso grupo demonstrou que a matriz extracelular de astrocitomas promove a seleçãode células endoteliais altamente proliferativas, porém com reduzida capacidade tubulogênica, além de determinar a morte de uma segunda sub-população endotelial, por desaderência ou anoikis. Estratégias de simulação dos teores de tenascina-C (TN-C) e fibronectina (FN) nas matrizes de astrocitomas, realizados com ambas as proteínas purificadas na forma de substratos definidos, sugeriram que o balanço TN-C:FN estava relacionado com os fenótipos endoteliais observados. No entanto, este procedimento não permitia abordar a participação de outros componentes da matriz tumoral nativa neste processo. Com objetivo de estudar a modulação do fenótipo angiogênico das células endoteliais por matrizes de astrocitoma, realizamos o silenciamento da expressão de TN-C na linhagem de astrocitoma U-373 MG. O silenciamento foi confirmado por western blotting, PCR em tempo real e ELISA, que permitiram concluir que, no período pós-transfecção (120h) necessário para se obter matrizes tumorais nativas para ensaios funcionais com células endoteliais, as células U-373 MG mantiveram-se silenciadas em índices superiores a 90%. A diminuição de TN-C nas matrizes tumorais resultou em um pequeno (≅18%, em média), porém significativo aumento na taxa de adesão endotelial. HUVECs incubadas com a matriz secretadas por células silenciadas apresentaram uma redução de ≅35% do número de núcleos picnóticos, quando comparadas a HUVECs incubadas com a matriz de células U-373 MG (selvagens ou transfectadas com siRNA controle). O silenciamento da expressão da TN-C na matriz nas células U-373 MG restaurou ainda o defeito tubulogênico das células endoteliais, que passaram a apresentar formação de tubos comparável à obtida quando HUVECs foram incubadas com sua matriz autóloga, rica em FN. Tais resultados apoiam observações anteriores do grupo, que já sugeriam que a maior proporção de FN na matriz autóloga, comparada a matriz do astrocitoma, seria o fator principal para a seleção dos fenótipos angiogênicos observados, demonstrando mais uma vez a importância do balanço FN:TN-C na regulação de processos angiogênicos. Dados anteriores sugeriam ainda que a sub-população endotelial que morre por anoikisapós contato prolongado (24 horas) com matrizes de astrocitomas corresponde a células que já haviam entrado na fase S do ciclo celular, no início da incubação. A fim de nos aprofundarmos sobre a participação do ciclo celular neste processo, a expressão da proteína p27, um inibidor de quinases dependentes de ciclinas (CKI), também foi analisada. HUVECs incubadas com a matriz de astrocitoma apresentaram um aumento de 2 a 3 vezes na expressão de p27, quando comparada com HUVECs provenientes de sua matriz autóloga. No entanto, células endoteliais incubadas com matriz secretada por células U-373 MG silenciadas apresentaram um nível de expressão de p27 comparável ao das HUVECs incubadas com matriz secretada por células selvagens, indicando que a expressão de TN-C não modula, ou não está diretamente correlacionada à expressão da proteína p27. Este resultado sugere que outros componentes da matriz tumoral devam estar envolvidos na modulação do ciclo celular endotelial.

A Tenascina-C e a sinalização celular na diferenciação tubulogênica endotelial

A matriz extracelular (MEC) é capaz de modular a adesão celular, induzindo processos de sinalização celular. No estado de aderência intermediária, induzido por proteínas matricelulares, as células tendem a se diferenciar, migrar e proliferar. A tenascina-C é uma proteína matricelular amplamente secretada em gliomas que está envolvida na proliferação e angiogênese tumoral. A MEC de gliomas, possui elevada incorporação de tenascina-C (TN-C), uma glicoproteína matricelular desadesiva que compete com a glicoproteína adesiva fibronectina (FN), desestabilizando os contatos focais e induzindo proliferação celular em gliomas. Neste trabalho nós nos propusemos a investigar o papel da TN-C tumoral no fenótipo angiogênico de células endoteliais. Recentemente em um trabalho publicado pelo nosso grupo observamos que as células endoteliais semeadas sobre matrizes de glioma (U373 MG) aderem menos e são deficientes na capacidade de formar tubos quando comparadas com àquelas plaqueadas sobre MEC de HUVECs. No entanto, neste trabalho, reproduzimos este fenótipo semeando as células endoteliais em suportes de TN-C /FN miméticos da composição da matriz tumoral nativa. Por western blotting, observamos um aumento na fosforilação em treonina 638 da proteína PKCα, um possível sítio inibitório, e um aumento na ativação de PKCδ. O efeito antagônico na regulação dessas isoformas de PKC foi demonstrado quando usamos inibidores seletivos de PKC α e δ e um ativador de PKCα (PMA). Observamos que quando tratamos as HUVECs plaqueadas sobre MEC de U373 com PMA, resgatamos a capacidade dessas células de formar tubos, o pré-tratamento dessas HUVECs com inibidor de PKC δ (rotlerina) resgatou parcialmente a capacidade tubulogênica dessas células. O pré-tratamento das HUVECs que foram semeadas sobre MEC da HUVEC (que formam tubos normalmente) com um inibidor de PKC α (RO320432) levou a diminuição da capacidade tubulogênica. Além disso, esta matriz também induz ativação de ERK e AKT. Investigamos também se o bloqueio dos diferentes domínios da TN-C na matriz derivada de glioma poderia, de alguma forma, reverter o defeito angiogênico das células, propiciado pela interação com a matriz extracelular de gliomas. O pré-tratamento da matriz extracelular de glioma com anticorpos anti-TN-C (contra os domínios FNIII 1-3, 4-5 FNIII e N-terminal) resgatou parcialmente a capacidade das células endoteliais de formar tubos. Nossos dados sugerem que a indução do fenótipo vascular observado em muitos gliomas, com predomínio de vasos mal formados e sub-funcionais, pode ser parcialmente devido ao comprometido da sinalização mediada por PKCs em células endoteliais, bem como do aumento da ativação das vias de ERK e Akt.

Avaliação dos níveis de metaloproteinases da matriz no fluido gengival durante a movimentação dentária ortodôntica

Durante o tratamento ortodôntico, a resposta inicial dos tecidos periodontais ao estímulo mecânico envolve várias alterações estruturais e bioquímicas que permitem a movimentação do dente. As metaloproteinases da matriz (MMPs) parecem desempenhar um papel importante na manutenção da integridade funcional da matriz extracelular periodontal. O objetivo do presente estudo foi avaliar, em diferentes intervalos de tempo, os níveis de metaloproteinases da matriz -1, -2, -3, -7, -8, -12 e -13 no fluido gengival (FG) de caninos superiores submetidos ao movimento de distalização e testar a hipótese de possíveis alterações nos níveis destas MMPs com o emprego de forças ortodônticas. Amostras de FG foram obtidas de dezesseis pacientes ortodônticos saudáveis (nove do sexo masculino e sete do sexo feminino, com idades entre 13 e 27 anos, média de idade 17,7 anos) que possuíam indicação de exodontias dos primeiros pré-molares superiores e tiveram os caninos distalizados como parte da terapia ortodôntica. Um dos caninos superiores foi distalizado ortodonticamente, sendo considerado dente teste. O canino contralateral não foi submetido a nenhuma força, no entanto foi incluído na aparatologia ortodôntica e utilizado como controle. A coleta de FG foi realizada nos sítios mesial (tensão) e distal (pressão) dos dentes testes e controles 7 dias antes da montagem da aparatologia ortodôntica, imediatamennte após a aplicação da força ortodôntica, e após 1 h, 24 h, e 7, 14 e 21 dias, respectivamente denominados -7d, 0h, 1h, 24h, 7d, 14d e 21d. A arcada superior de cada paciente foi dividida em um lado teste e um lado controle. Os resultados mostraram que foram encontradas diferenças significativas no volume do FG apenas nos intervalos de tempo entre -7d e 0h nos lados controle-pressão (CP), teste-tensão (TT) e teste-pressão (TP). Em TP foi observado ainda aumento do volume entre os tempos 0h e 14d. Foi possível detectar no FG as MMPs estudadas nos lados controle/teste e lados pressão/tensão, em todos os intervalos de tempo. As flutuações dos níveis das MMPs apresentaram poucas alterações significativas nos diferentes intervalos de tempo, nos lados controle/teste e lados pressão/ tensão. As diferenças intergrupos (TT, TP, CT e CP) em cada tempo não mostraram resultados significativos assim como as comparações entre os lados pressão e tensão para cada tempo individualmente. Os níveis de expressão da MMP-8 foram muito superiores aos das outras MMPs avaliadas, porém sem diferenças signficativas entre os lados teste e controle.

Participação do L-NAME, da L-arginina e da N-acetilcisteína no enfisema pulmonar induzido por fumaça de cigarro em camundongos

O óxido nítrico (NO) constitui um dos mais importantes mediadores intra e extracelulares e tem sido descrita sua participação tanto em processos biológicos como patológicos. Nosso objetivo foi verificar se o aumento ou a diminuição do óxido nítrico apresenta um efeito benéfico na proteção do tecido pulmonar no enfisema pulmonar induzido por fumaça de cigarro em camundongos. Para tanto, utilizamos o L-NAME (inibidor do NO), a L-arginina (substrato para a formação do NO) e os comparamos com a N-acetilcisteína (utilizada no tratamento da DPOC). Foram utilizados 65 camundongos C57BL/6 machos. Cinquenta animais foram divididos em grupos controle, fumaça de cigarro (FC), fumaça de cigarro + L-NAME (FC+LN), fumaça de cigarro + L-arginina (FC+LA), fumaça de cigarro + N-acetilcisteína (FC+NAC) (n=10, por grupo). Durante sessenta dias 40 animais foram expostos a 12 cigarros comerciais por dia, 3 vezes ao dia. Os grupos controle e FC foram submetidos à gavagens orogástricas com o veículo. Os grupos FC+LN, FC+LA, FC+NAC receberam gavagens diárias de L-NAME (60 mg/kg), L-arginina (120 mg/kg) ou NAC (200 mg/kg) respectivamente. Quinze animais (n = 5, por grupo) foram expostos ao ar ambiente e tratados apenas com L-NAME, L-arginina e NAC. Realizamos a análise do perfil das células do lavado broncoalveolar após o sacrifício. O pulmão direito foi removido para as análises histológicas do alargamento dos espaços aéreos determinado pela medida do diâmetro alveolar médio (Lm) e da densidade de superfície (Sv) dos septos alveolares. Os pulmões esquerdos foram removidos e homogeneizados para a as análises da atividade enzimática (SOD, CAT e MPO) e do sistema glutationa (GSH/GSSG), para a análise dos valores de nitrito e da expressão de 4-HNE, MMP-12, NE, TIMP-1, TIMP-2. Nossos resultados apontam que o L-NAME tem uma ação voltada para a matriz extracelular (via protease-antiprotease), enquanto que a L-arginina possui uma ação voltada para os oxidantes, assim como a NAC. Porém a NAC atua aumentando os níveis de glutationa, o que interfere diretamente nos oxidantes (via oxidante-antioxidante), enquanto a L-arginina interfere aumentando o burden oxidativo concomitante a um aumento da velocidade de ação dos oxidantes o que aumenta as células inflamatórias, mas diminui seu tempo de ação permitindo uma maior proteção. Concluímos que tanto o favorecimento para a produção e liberação do NOatravés da administração da L-arginina quanto a inibição do NOpela utilização do L-NAME foi eficiente na proteção do pulmão, apesar de não terem alcançado um resultado tão bom quanto a NAC.

O uso de células-tronco na regeneração dos tecidos dentários e periodonto

Os estudos abordando a regeneração dos tecidos dentários ganharam uma nova perspectiva com a utilização das células-tronco. E novas perspectivas têm surgido com a bioengenharia tecidual e as terapias periodontais e pulpares regeneradoras. O objetivo deste trabalho foi desenvolver o modelo experimental de autotransplante em ratos visando compará-lo à técnica de reimplante e estudar a capacidade terapêutica das células da medula óssea em diferentes biomateriais utilizados como matriz para a terapia de células-tronco no reparo dos tecidos dentais. Foram utilizados 23 ratos Wistar divididos em grupos de 1, 3, 15 e 60 dias para as técnicas de reimplante e autotransplante. Os grupos com injeção de células-tronco (CT) foram: (1) grupo de 3 dias, combinado à técnica de reimplante; (2) grupo de 15 dias com ambas as técnicas. Blocos contendo os três dentes molares superiores de cada lado dos ratos foram removidos, feitas radiografias periapicais e as peças foram processadas para inclusão em parafina. Foram avaliadas a espessura do ligamento periodontal (LPD) comparada entre os diferentes grupos e a morfologia celular e matriz extracelular relacionadas à superfície radicular, ao osso alveolar e à porção média do LPD, além das células da polpa dental de cada grupo. As células isoladas a partir da medula-óssea foram incubadas por 24h, 48h, e 72h em placas de cultura contendo membranas de colágeno bovino tipo I - CollaTape (Integra LifeSciences Corporation, Plainsboro, NJ, USA), enxerto ósseo - Extra Graft XG-13 (Silvestre Labs Quimica e Farmaceutica LTDA, RJ, Brazil) ou um dente molar de rato. Os espécimes foram observados em um microscópio invertido para contagem de células e processadas para observação no microscópio eletrônico de varredura (MEV). Os grupos de 1 e 3 dias apresentaram medidas de LPD significativamente maiores para a técnica de autotransplante quando comparadas ao reimplante. O grupo de 3 dias com CT não apresentou alterações pulpares significativas, diferente do controle (sem CT) O grupo de 15 dias com CT apresentou as mesmas características histológicas do grupo sem injeção de CT. A observação ao MEV dos biomateriais revelou que as células apresentaram pouca adesão e proliferação no enxerto ósseo e no cemento dentário quando comparados à membrana colágena. A técnica de reimplante associada à injeção de células-tronco sugere alguma influência da terapia com as células-tronco sobre a polpa. As distâncias aumentadas no LPD com a técnica de autotransplante podem não influenciar tanto o sucesso da técnica. As células mesenquimais da medula óssea possuem grande potencial para colonizarem a membrana colágena CollaTape que mostrou vantagens sobre o enxerto ósseo Extra Graft XG-13 como biomaterial para a aderência e a proliferação de células mononucleares da medula óssea, permitindo a diferenciação destas células.